淫羊藿黄芪口服液的工艺研究

摘要　目的优化淫羊藿黄芪口服液的制备工艺方法以均匀设计法设计提取工艺以黄酮多糖及淫羊藿苷的含量为指标进行筛选并以此作指标对冷沉法醇沉法ZTC1+1Ⅲ型澄清剂法壳聚糖法的澄清效果进行比较结果提取的优化条件为50%乙醇溶液9倍于药材的溶剂量提取二次4h2h两种澄清剂及冷沉法对多糖黄酮及淫羊藿苷无明显影响效果优于醇沉法结论均匀设计的结果与实际效果相吻合为一可行性的研究方法澄清法优于其他方法为澄清技术改革提供依据
　　关键词　淫羊藿　黄芪　口服液　工艺研究　均匀设计　澄清技术

中医理论认为肾病源于精气不足关键是补精气淫羊藿补精血黄芪补气现代临床结果表明［1］淫羊藿黄芪口服液具有提高血中白蛋白降低血粘性对肾病综合征有协同治疗作用其主成分为淫羊藿苷总黄酮黄芪甲苷及两者的多糖为此选择合适的提取澄清方法对确保有效成分的溶出和减少澄清时的损失确保制剂的质量显得尤为重要本文以主成分淫羊藿苷总黄酮多糖为指标从提取工艺及澄清剂选用进行工艺优化

1　药物试剂与仪器

淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.黄芪［蒙古黄芪Astragalus membranaceus Fisch.Bge. var monholicusBge Hsiao］购于广州市药材公司经广东药学院生药教研室鉴定淫羊藿苷对照品中国药生物制品检定所批号990427葡萄糖对照品中国药品生物制品检定所批号 990812壳聚糖珠海前山科技发展实业公司批号990908ZTC1+1Ⅲ澄清剂天津正天成澄清技术有限公司赠品蒽酮中国医药集团上海化学试剂公司批号991116硫酸乙醇氯仿乙酸乙酯均为分析纯甲醇为色谱纯
　　756MC型紫外-可见分光光度计上海第三分析仪器厂高效液相色谱仪Waters 810

2　方法

2.1　质量指标的建立
　　以提取液中所含的主要成分多糖黄酮和淫羊藿苷为质控指标
2.1.1　多糖标准曲线的建立［2］　精密称取经恒重的葡萄糖对照品5.0mg以蒸馏水配成贮备液100μg/ml分别取贮备液0.200.300.400.600.801.00ml加蒸馏水至2.0ml加入0.2%的蒽酮硫酸试液4.0ml摇匀于波长625nm处测定吸光度结果得回归方程C=54.9A+0.790,r=0.9977,线性范围20～100μg/ml
2.1.2　黄酮标准曲线的建立　精密称取淫羊藿苷105℃恒重10mg,加甲醇溶解制成对照品溶液25μg/ml精密吸取对照品溶液0.01.02.05.07.09.010.0ml分别置10ml量瓶中甲醇定容分别精密吸取2ml加入1.00ml硝酸铝甲醇4%溶液摇匀于波长418nm处测定吸光度同时作空白对照回归方程为C=80.0A+1.25,r=0.9991,线性范围2.50～25.0μg/ml
2.1.3　淫羊藿苷标准曲线的建立　HPLC法［3］精密吸取上述对照品溶液0.01.02.05.07.09.010.0ml置10ml量瓶中甲醇定容摇匀0.45μm滤膜滤过10μl进样色谱条件甲醇-水50∶501.0ml/minλ=270nm,μBondapak C18300mm×4.0mm,10μm得回归方程C=0.0689+5.05×10-5A,r=0.9988,线性范围2.5～25μg/ml
2.2　均匀设计优化提取工艺
2.2.1　方案设计及提取　根据药材主成分的性质影响淫羊藿及黄芪提取效果的主要因素有回流提取时间A提取次数B乙醇的浓度C溶剂量与药材量比D为此以4因素8水平并选用U998［4］安排实验以多糖黄酮淫羊藿苷的含量变化作指标进行筛选见表1
　　具体提取方法分别取淫羊藿黄芪各20g切成约0.5cm厚的饮片按编号加入溶剂进行回流提取收集提取液浓缩后滤过置100ml量瓶中定容备用
2.2.2　含量测定

表1　实验安排及结果
编号  因素  指标
Ah  B次  C乙醇浓度  D溶剂倍数  多糖mg/g  黄酮mg/g  淫羊藿苷mg/g
1  0.51  12  504  147  31.24  18.51  0.938
2  1.02  24  908  125  11.81  25.25  1.328
3  1.53  36  303  103  50.53  22.72  0.721
4  2.04  48  807  81  14.52  28.53  1.307
5  2.55  11  202  158  52.24  19.69  0.756
6  3.06  23  706  136  36.55  26.12  1.312
7  3.57  35  01  114  96.04  19.94  0.812
8  4.08  47  605  92  73.50  37.15  1.714
2.2.2.1　多糖含量测定　提取液离心5min3000 r/min精密吸取取上清液5ml加适量85%乙醇沉淀二次弃掉上清液沉淀用无水乙醇洗涤二次移置50ml量瓶中加水至刻度摇匀稀释成合适浓度按2.1.1法测定多糖含量
2.2.2.2　黄酮的含量测定　精密吸取离心后的上清液0.1ml置50ml量瓶中加甲醇至刻度按2.1.2法测定黄酮含量
2.2.2.3　淫羊藿苷的测定　精密吸取离心后的上清液5.0ml置分液漏斗中用30ml氯仿分3次抽提弃掉用30ml乙酸乙酯分三次萃取合并水浴挥干复溶于10ml甲醇中按2.1.3用0.45μl滤膜滤过进行测定计算含量
2.2.3　加样回收试验　经实验测定葡萄糖黄酮淫羊藿苷测定法的回收率分别为100.8%99.8%99.4%RSD分别为2.22.00.87n=4
2.2.4　验证试验　根据均匀设计实验结果要多糖黄酮淫羊藿苷的溶出较高优化条件为取等量的淫羊藿黄芪加入9倍量50%乙醇回流提取2次第1次4h第2次2h浓缩至1∶2.5浓缩液测定指标成分的含量验证三批结果见表2经统计软件SPSS 8.0进行T检验结果P>0.05实验值与预测值无显著性差异

表2　优选条件验证结果
　  多糖
mg/g  黄酮
mg/g  淫羊藿苷
mg/g
第1次  70.98  37.45  1.701
第2次  67.76  32.36  1.432
第3次  64.92  30.84  1.290
均值  67.89  33.55  1.474
SD  3.032  3.462  0.209
预测值  68.88  32.01  1.425
P  0.628  0.522  0.722
2.3　不同澄清工艺对比
2.3.1　提取　根据均匀设计实验结果所定提取工艺取等量的淫羊藿黄芪加入9倍量50%乙醇回流提取2次4h2h合并滤液浓缩至1∶2浓缩液分装5瓶
2.3.2　澄清剂的配制　1%壳聚糖醋酸溶液壳聚糖用1%醋酸浸泡溶胀并溶解成1%粘稠浅黄色溶液
　　ZTC1+1ⅢA组分配成1%水溶液B组分用1%醋酸溶解配成1%的醋酸溶液
2.3.3　澄清工艺
2.3.3.1　壳聚糖法　取滤液100ml置150ml带塞锥形瓶中加入10ml 1%壳聚糖醋酸溶液80℃水浴加热30min放冷离心滤过上层为棕褐色的澄清溶液按2.2.2含量测定法测定多糖黄酮淫羊藿苷的含量
2.3.3.2　ZTC1+1Ⅲ澄清法　取滤液100ml置250ml带塞量瓶中加热至60℃按5B∶3A的比例先加入组分B搅拌使其均匀分散再加入组分A搅拌然后冷藏24h离心分离将溶液调节pH6.0滤过得棕黄色的溶液按2.2.2含量测定法测定多糖黄酮淫羊藿苷的含量
2.3.3.3　醇沉法　取滤液100ml加入95%乙醇至约80%静置48h上清液滤过滤液回收乙醇加水至100ml冷藏24h滤过按2.2.2含量测定法测定多糖黄酮淫羊藿苷的含量
2.3.3.4　冷沉法　取滤液100ml冰箱4℃冷藏1周离心滤过按2.2.2含量测定法测定多糖黄酮淫羊藿苷的含量
2.3.4　未经处理原液主成分含量测定　取原液适量按2.2.2含量测定法测定多糖黄酮淫羊藿苷含量

3　结果

3.1　均匀设计提取工艺优化结果
　　各种提取方法的多糖黄酮淫羊藿苷的含量见表1运用SPSS 8.0统计软件进行逐步回归分别得回归方程
　　多糖Y=63.974+11.574A-0.622C-1.143D　F=12.219　R=0.950
　　黄酮Y=21.615+2.958A+0.124C-0.849D　F=8.53　R=0.930
　　淫羊藿苷Y=0.300+0.170A+1.039×10-2C-8.19×10-3D　F=12.236　R=0.950
　　回归方程的结果表明影响多糖提取的主要因素为提取的时间和含醇量时间越长含醇量越低提取效果越好而对于黄酮和淫羊藿苷影响提取的主要因素是时间和含醇量时间越长含醇量越高提取量越大考虑到三种成分的量选用50%的乙醇浓度加入9倍的溶剂量提取2次4h2h为优化条件从确证实验结果可知实验值与计算值无显著性差异
3.2　澄清工艺结果比较
　　壳聚糖法ZTC1+1Ⅲ醇沉法冷沉法对多糖黄酮淫羊藿苷含量的影响见表3

表3　不同澄清法对主成分含量的影响
方法  多糖
mg/g  黄酮
mg/g  淫羊藿苷
mg/g
未处理  74.50±1.63  37.75±0.755  1.735±0.015
壳聚糖  63.58±1.082  33.91±0.576  1.404±0.0174
ZTC1  66.88±1.348  35.49±0.597  1.478±0.025
醇沉法  6.393±0.262  15.57±0.396  0.875±0.00578
冷沉法  33.08±0.853  31.19±0.675  1.343±0.0275
　　经两两统计比较未处理壳聚糖法ZTC1+1Ⅲ法冷沉法及醇沉法之间均有显著性差异结果表明不同澄清法对主成分含量有不同程度的影响从综合效果来看ZTC1+1Ⅲ法>壳聚糖法>冷沉法>醇沉法

4　讨论

4.1　以均匀设计逐步优化法能有效准确地筛选影响提取效果的主要因素从回归方程可见主成分的溶出主要与时间乙醇浓度有关对多糖而言醇度越高提取率越低黄酮淫羊藿苷反之而与提取次数无关但事实上提取的次数也是反映提取时间的长短对溶出的影响溶剂量的增大反而提取效果降低原因可能是过多的溶剂在浓缩时主成分破坏所致实验表明均匀设计是适用于多因素的筛选
4.2　以壳聚糖ZTC1+1Ⅲ作澄清剂代替传统的醇沉法一方面可有效地除去杂质确保口服液澄清另一方面对多糖黄酮淫羊藿苷影响较少而醇沉法影响较大从效果而言ZTC1+1Ⅲ法>壳聚糖法>冷沉法>醇沉法因此以壳聚糖或ZTC1+1Ⅲ取代醇沉法可减少工序提高生产效率和有效成分的浓度
4.3　从表3的结果可见　壳聚糖或ZTC1+1Ⅲ均可引起的主成分含量下降而醇沉法影响较大原因可认为沉淀形成的方式和形态不同引起主成分吸附量不同因此为减少这种影响澄清剂的用量使用条件的优化需作进一步研究