程序冷冻仪的胚胎冷冻降温的工艺

程序降温仪怎么进行胚胎程序冷冻首先三步平衡法

（1）10%甘油保存液的配制

取9毫升20%羊血清的PBS加入1毫升甘油用吸管反复混合15～20次经0.22微米滤器过滤到灭菌器内待用

（2）取含20%羊血清0.3摩尔蔗糖的PBS 2毫升和3.5毫升分别加入10%甘油3毫升和1.5毫升配成含6%和3%甘油的蔗糖冷冻液将3%6%和10%三种甘油浓度的冷冻液分别装入小培养皿

（3）胚胎分别在3%6%和10%甘油的冷冻液中浸5分钟

（4）胚胎装管

用0.25毫升塑料细管按以下顺序吸入少量的10%甘油的PBS液气泡10%甘油的PBS液（含有胚胎）气泡少量的10%甘油的PBS液加热封口两道（图9-18）

图9-18 胚胎装管示意图

（5）塑料细管的编号

剪一段（2厘米）0.5毫升塑料细管作为标记外套内装色纸注明供体品种耳号胚胎发育阶段及等级制作日期（年月日）并在外套管上写明序号备查

（6）利用欣谕程序冷冻仪进行冷冻程序

将细管直接浸入欣谕程序冷冻仪以1℃/分钟的速度从室温降至-6℃停5分钟后植冰再停留10分钟以0.3℃/分钟的速度降至-36℃再以0.1℃/分钟的速度降至-60℃当然如果考虑成活率更高的话可以用欣谕胚胎冷冻仪直接程序降温到-180度然后再直接投入液氮长期保存

（7）冷冻胚胎的解冻

①解冻液的配制 根据上文所述配制出10%6%和3%甘油的蔗糖解冻液用0.22微米过滤器灭菌分装在小培养皿内第1～4杯分别为10%6%3%0%甘油的蔗糖解冻液第5杯为PBS保存液

②胚胎的解冻 胚胎从液氮中取出利用程序冷冻仪进项程序回温

③三步脱甘油 用70%酒精棉球擦拭塑料细管和剪刀刃剪去棉塞端与带有空气的1毫升注射器连接再剪去细管的另一端在室温下将胚胎推入10%甘油和0.3摩尔蔗糖的PBS解冻液中放置5分钟后依次移入6%3%和0%甘油的蔗糖PBS解冻液中各停留5分钟最后移至PBS保存液中镜检待用